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Cas9是DNA扩增中的新生儿

无论是揭示具有DNA证据的犯罪者,诊断病原体,对古生物学发现进行分类,还是确定亲子关系,核酸的重复(扩增)都是必不可少的。在Angewandte Chemie期刊上,科学家们现在推出了一种新的,非常简单但高度灵敏且可靠的方法,避免了通常的加热和冷却步骤,以及复杂的仪器。试剂可以冷冻干燥,这种通用方法可以在实验室外使用。

最常用的扩增方法是聚合酶链反应(PCR),它基于对功率需求高的特殊仪器中多次热循环的重复。例如,难以在实验室外,患者床边或远程位置执行。没有热循环的替代方法通常是复杂的或不够灵敏,需要昂贵的试剂,或者不是广泛适用的。

与中国上海华东理工大学的Bin-Cheng Yin和Bang-Ce Ye合作的研究人员现已开发出一种新的,廉价的方法:基于Cas9n的扩增反应(Cas9nAR),它由一步组成在均相溶液中,并在37℃的恒定温度下进行。

在这种方法中,研究人员使用来自细菌“免疫系统”的成分。例如,当细菌被病毒感染时,它们将外来遗传物质切成小块并将它们引入它们自己基因组的特定区域。在随后感染的情况下,细菌的RNA链“识别”这些序列并指导特殊的“遗传剪刀”来切割外源DNA。这些工具也被用于现代基因工程。

Yin,Ye和他们的同事改变了称为Cas9的遗传剪刀,使其不再完全切断DNA。相反,它只穿过一条线,引入了“缺口”。这种酶被称为“切口酶”。与细菌系统一样,Cas9切口酶与RNA链结合,这决定了切口的位置。例如,可以制备该RNA,使其识别病原体特征的DNA序列。然后Cas9切口酶切割紧邻的DNA。

对于这项新技术,研究人员制作了两种不同的Cas9切口酶RNA复合物,它们在两个不同的位置切割DNA。PCR中常用的聚合酶(exo_Klenow聚合酶)从第一个切口开始补充切割链,将旧链自由地设置,直到它到达第二个缺口。新完成的DNA被切口酶复合物反复切口并补充。该过程释放的短单链成为在第二个循环中进一步扩增的起点。除了切口酶复合物和聚合酶之外,唯一需要的是两个合适的引物作为拷贝的起始点。

用细菌基因组DNA片段进行的测试表明,靶序列被精确识别和扩增。在20μl的体积中,可以检测单个分子。可以以高特异性检测基因内单个核苷酸的差异。

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